IF：8.4

研究思路：靶點結構分析，數據庫虛擬篩選，激酶活性實驗，細胞實驗、化合物結構優化、體外實驗驗證，體內實驗，分子水平作用機制，藥物作用模式分析，作用機制實驗。

一、背景

? ? ? ?再生肝磷酸酶(PRL)癌蛋白是在多種腫瘤組織中過度表達的磷酸酶。PRL水平升高與腫瘤的轉移和不良的臨床結果有關。理論上，PRL磷酸酶可以提供有效的治療靶點，但由于缺乏特異性靶向它的化合物，PRL磷酸酶在腫瘤治療上仍然沒有得到足夠的利用。

二、目的

? ? ? ? PRL磷酸酶是通過三聚體來發揮利用，利用這種獨特的性質，借助虛擬篩選和藥物化學的方法，尋找能夠破壞這種三聚體結構的化合物，從而抑制PRL磷酸酶的活性。通過體外和體內實驗，驗證化合物的抗腫瘤效果。

三、方法

? ? ? 虛擬篩選：從ZINC database中，篩選能與PRL1單體間界面結合的化合物。分兩步對接，剛性對接（DOCK6.2），柔性對接（圖1A、B）。

圖1 PRL1三聚體結構（A）及虛擬篩選流程（B）

激酶活性實驗：體內、體外。

細胞實驗：劃痕實驗、細胞遷移實驗。

化合物結構優化：細胞遷移實驗驗證。

體外實驗驗證：構建表達?PRL磷酸酶的細胞和表達三聚體缺陷PRL磷酸酶的細胞。細胞遷移實驗驗證。

體內實驗驗證：小鼠實驗，表達PRL磷酸酶的小鼠和PRL磷酸酶缺失小鼠的胚胎成纖維細胞。

分子水平作用機制：PRL 1通過激活ERK 1/2和AKT途徑促進細胞增殖和遷移，探究化合物對ERK 1/2和AKT途徑的影響。

藥物作用模式分析：驗證化合物作用于PRL的三聚體界面。

作用機制實驗：黑色素瘤TCGA表達數據驗證PRL 1的促癌作用，體外和體內實驗驗證化合物的抑癌機制。

四、研究成果

經兩步虛擬篩選后，得到56 hits，體外和體內激酶實驗，篩選到3個化合物（圖2C）能夠顯著降低細胞內PRL1三聚體的形成，其中Cmpd-43最顯著（圖2D）。Cmpd-43對細胞的侵襲和遷移也有一定的抑制作用（E、F）

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圖2?3 hits（C）、體內激酶試驗（D）細胞實驗（E、F）?

? 對Cmpd-43結構進行優化，得到7個類似物（圖3A），細胞的遷移實驗表明，類似物 -3顯示出與CMPD-43相似的效果，而類似物2和4-7似乎比CMPD-43略小。但是類似物-1對細胞增殖或遷移沒有影響，這表明在類似物-1中缺失的亞氨基甲基芳族部分對PRL1三聚體抑制活性是關鍵的（圖3B）。

圖3?Cmpd-43及其類似物對細胞增殖或遷移的影響

?表達 PRL磷酸酶的細胞促進了細胞的增殖和遷移，而表達三聚體缺陷PRL磷酸酶的細胞增殖和遷移能力和對照細胞相似，說明PRL磷酸酶的三聚體結構在促進細胞增殖和遷移中扮演重要的角色（圖4?A、B）。用Cmpd-43和類似物-1處理表達 PRL磷酸酶的細胞和表達三聚體缺陷PRL磷酸酶的細胞。Cmpd-43能抑制表達 PRL磷酸酶的細胞，其余的處理組均沒有抑制效果（圖4?C）。小鼠實驗也證明，Cmpd-43能抑制表達 PRL磷酸酶的細胞，而對PRL磷酸酶缺失的細胞無影響（圖4?D）。WB實驗驗證，CMP D-43(5 mmol/l)能特異性抑制Prl 1介導的HEK 293細胞ERK 1/2和AKT通路的活化。

圖4?Cmpd-43及類似物-1對表達PRL磷酸酶/PRL磷酸酶缺陷細胞的影響

?為了驗證Cmpd-43是作用于PCL的三聚體界面，從而發揮抑制作用，我們將類似物-3和Cmpd-43分別與PRL磷酸酶共結晶，得到了類似物-3結合的PRL1的共晶體，通過結合模式的分析，發現類似物-3確實是與PCL的BC界面結合，并且與周圍的氨基酸殘基作用形成了穩定的構象（圖5 ABC）。類似物-3與?Tyr14 and Phe132具有較強疏水性接觸，而對二聚體界面結合表面的分析表明，這兩種殘基對三聚體形成的貢獻十分有限，因此推測，這兩個殘基突變會影響類似物-3與PCL的結合，但是不會影響PCL的三聚體結構。我們對Tyr14 and Phe132進行了Ala替換。?結果發現，用Ala取代bar 14和ph 132對PCL三聚和PCL介導的細胞遷移沒有影響（圖5 DE），并且突變體對Cmpd-43呈現出抗性。這些結果表明類似物-3和Cmpd-43是結合在PRL三聚體界面并防止PRL三聚反應。

圖5 類似物-3和Cmpd-43結合到PRL磷酸酶三聚體界面并阻止PRL三聚結構形成

黑色素瘤TCGA表達數據驗證PRL 1的促癌作用（圖6 ABC）Cmpd-43能抑制人黑色素瘤細胞的增殖和遷移（圖6 DE）。Cmpd-43也能降低HGF誘導的Erk1/2和Akt磷酸化（圖6FG）。除了PRL 1，PRL 2和PRL 3也能形成三聚體結構，通過敲除起主要作用的PRL 1和PRL 2，發現細胞的ERK1/2 and Akt通路受到抑制（HI），說明Cmpd-43能夠同時抑制PRL 1，PRL 2和PRL 3的活性。

圖6 Cmpd-43對黑色素瘤細胞系MeWo.具有抑制作用

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黑色素瘤小鼠模型實驗，再次驗證Cmpd-43通過抑制ERK1/2 and Akt通路，起到抑癌作用（圖7）。

圖7?Cmpd-43在體內抑制黑色素瘤移植瘤的生長